自从第一个在青蛙淋巴液中维持青蛙神经纤维的体外细胞培养实验以来,科学家们一直在寻找最佳体外细胞培养的培养基成分。
多年来,陆续研发出动物源性培养基和人工培养基。人工培养基例如Eagles培养基及其改良的Eagles培养基(MEM) 和Dulbecco的MEM (DMEM),以及Ham F10、F11和 F12。然而并非所有细胞都在此类人工培养基中进行繁殖。
1958年Theodore T. Puck首次引入了胎牛血清(FBS/FCS)来刺激细胞和组织在体外增殖,惊喜地观察到细胞在含有胎牛血清的培养基中,可以维持更长时间的活性,同时生长状态也更佳。自此,体外培养迎来新世代。
什么是血清
血液凝固后,在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后,分离出的淡黄色透明液体。
胎牛血清(FBS)指还在母牛身体里的小牛,通常5-8个月胎龄,之后对未发育完全的胎牛的心脏穿刺取血,完成采血的工作以后便再通过一系列的工艺处理获得胎牛血清。
胎牛血清与新生牛血清(NBS)所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组份与比例不同,胎牛血清含有胚胎发育所必需的生长因子。
牛属于哺乳动物,母牛从受精到生产一般要十个月左右的时间,部分生长因子到达8月后开始逐渐消失,所以胎牛血里的生长因子适合牛体内各种细胞生长。此外,胎牛血清的免疫球蛋白含量要远远低于新生牛血清,培养细胞的效果会更好。
研究表明胎牛血清中含有激素、维生素、转运蛋白、微量元素、扩散因子和生长因子等细胞体外增殖和维持的必需成分,现已被广泛用作研究、生物技术和制药中人类和动物(包括昆虫)细胞培养基的通用补充剂。
血清的作用
Ø 提供细胞生长基本的营养物质,如氨基酸、维生素、脂类物质、无机物、核酸衍生物等。
Ø 提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白,通过与上述物质的结合,携带重要地低分子量物质,在细胞代谢过程中起着重要作用。
Ø 提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子,如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等。
Ø 提供促接触和伸展因子,使细胞贴壁免受机械损伤。
Ø 提供蛋白酶抑制剂,中和细胞释放的蛋白酶,使细胞免受蛋白酶的损伤。
Ø 影响培养系统中的某些物理特性如:剪切力、黏度、渗透压和PH等。如血清具有一定的粘度,可以保护细胞免受机械损伤。
尽管使用广泛,但胎牛血清在细胞培养中面临着诸多问题和风险。
来自瑞士弗里堡大学 Adolphe Merkle 研究所 (AMI) 的生物纳米材料组和英国斯旺西大学医学院的体外毒理学组 (IVTG) 两个不同的实验室进行了体外实验,这些实验应用了相同的实验程序并使用了来自同一供应商的A549细胞和胎牛血清,他们得到的结果大不相同。进一步分析表明,细胞反应差异的一个原因是细胞培养基中添加了来自不同批次的胎牛血清。
批次间的较大差异使得实验的可重复性降低。
两个实验室在相同实验方法下的结果比较 (a) 细胞活力 (b) 细胞增殖(细胞数量)(c) 跨上皮电阻。
此外2002年有研究发现培养基支原体污染中的牛莱氏无胆甾原体和精氨酸支原体来源于牛血清。一旦细胞培养发生病毒污染,通常归因于细胞培养中所有的胎牛血清。
因此,胎牛血清的品质至关重要。
国内外胎牛血清存在差异的原因,除了采血时间定义、血清混搭稀释之外。最主要的是牛的生长环境和抗生素的使用标准。
国外抗生素的使用严格,用量少。每头奶牛的产品包括血清都可以溯源的,可以做到胎牛血清中不含抗生素或含量极低。高残留的抗生素等物质,会严重影响细胞的生长。
NEST选用南美乌拉圭血源,每一批血清的生产都受到严格的控制,从血清的收集和整个处理和生产的所有阶段,按照符合欧洲法规进行处理,一直到最终包装做到全程的质量控制。
NEST胎牛血清血源地证明
此外,NEST每一批血清都会进行完善的检测。
1. 支原体:每产品批次都要检测有无支原体。通过培养方法检测血清是否存在支原体。
2. 无菌性:产品均基于欧洲药典或美国药典进行无菌性检测,确保无细菌、酵母、大肠杆菌噬菌体等。无菌过滤、无菌分装,每生产批次中均会抽样进行无菌测试。
3. 血红蛋白:血红蛋白具有氧化性,过高会导致细胞受损。采用分光光度计测量残留血红蛋白水平。
4. 细胞培养试验:每批胎牛血清都被测试特定细胞系的体外培养效果。从细胞生长、铺板效率、克隆效率三方面评判。测试细胞种类:HeLa,L929,SP2/0-AG14,MRC-5
选用指南