果蝇的神经递质系统与哺乳动物系统非常相似，它们有许多类似的大脑结构，涉及类似的行为，并且许多已知影响哺乳动物行为的基因在果蝇中存在并执行相同的功能。强迫游泳试验（FST）已被广泛用于评估化合物的抗抑郁功效，果蝇也尝试采用这种试验。蝇类强迫游泳试验有可能成为评估潜在抗抑郁药物的一种经济高效、高通量的检测方法。


强迫游泳测试（FST）是一种行为绝望范式，经常用于大鼠，以测量应对不可避免的逆境应对策略，其中被动应对策略（不动）被解释为抑郁样，而减少不动则作为抗抑郁药样的证据 效果。FST可用于筛选给予其他健康大鼠药物的抗抑郁作用，用于抑郁症动物模型中的被动应对策略，或用于研究抑郁症的动物给予药物的抗抑郁样作用。

在这项研究中，我们使用与抗抑郁症有关的methamphetamine（METH）、DL-α-methyltyrosine（αMT）、citalopram（CIT）以及psilocybin（PSI）、5-HT1A受体拮抗剂 WAY 100635（WAY）和5-HT2受体拮抗剂 Ketanserin（KET），对果蝇运动活动以及FST的影响进行了药理评估。

方法
果蝇活动监测系统用于测量随时间变化的运动活动。将雌雄苍蝇分别放入透明的试管中，试管的一端塞有松散的棉花团，另一端装有食物培养基和塑料盖。食物培养基为vehicle、METH（5.0 mM）、αMT（3.0 mM）、CIT（0.3、1.0 或 2.5 mM）、PSI（0.03 mM、3.5 mM）、KET（1.0 mM）或 WAY（1.0 mM）。1×表示在分组条件下用处理食物喂养苍蝇24小时，之后转移到vehicle培养基的试管中，用vehicle培养基中的PSI（0.03 mM）喂养苍蝇 1 天，然后用vehicle培养基喂养苍蝇 4 天。5×表示苍蝇在上述试管中连续喂食处理食物5天。将苍蝇放入活动监测系统，每个处理组的雌雄蝇各为n= 16，并在恒定光照条件下饲养至少 5 天，同时进行监测。所有其他苍蝇均在恒定光照条件下饲养 5 天，然后在 FST 中进行测试，每个处理组中雌雄各n= 7 只，FST 中的单个数据点代表 16 只苍蝇的平均行为。如图 1所示。

图1

果蝇强迫游泳测试(FST)用于测量两种实验室6天龄雄性和雌性的不动行为。将一天龄（5×）或两天龄（1×）的未被诱导的苍蝇进行短暂麻醉，并分别放入塑料管中。然后将这些试管棉花状放入200 mL移液器吸头盒的支架中，并在恒定光照下放置至第5天。在4孔室载玻片上每孔放置一只果蝇，对苍蝇的FST行为进行评估。使用顶置摄像头记录苍蝇在孔中最初5分钟的FST行为，以便随后使用动物运动轨迹跟踪系统分析首次不动的潜伏期、不动的时间和不动的次数。为了验证苍蝇是否具有活动能力，在录制5分钟视频后，用工具将每只苍蝇轻轻取出并放到纸巾上。任何不能立即离开的苍蝇都被认为是淹死的，随后被排除在最终分析之外。由于CS果蝇的不同亚品系已显示出运动活动差异，因此在强迫游泳测试中比较了两种 CS 亚品系（CSX和CSCLWU）。


结果
强迫游泳行为和整体运动活动因性别、剂量和给药策略而异
在果蝇活动监测中分析发现，性别和治疗之间存在显著的相互作用，以及性别引起的显著变化和治疗。饲喂vehicle培养基的CSX雌性和雄性比同性CSCLWU显著更活跃（图2A）。CSX和CSCLWU雄性的活跃程度显著低于同品系雌性。PSI (0.03 mM) 增加了 CSX 雌性果蝇的运动活动，但不增加CSX雄性或 CSCLWU 果蝇的运动活动。

在FST中，对自变量性别（雄性、雌性）和品系（CSX、CSCLWU）进行双向方差分析发现，性别和品系之间存在显著的交互作用，以及性别引起的显著变化和应变。雄性比雌性和CSX雄性更加不动，但雄性和雌性CSX果蝇之间没有观察到差异（图2B）。CSX 雌性和雄性的不动次数明显少于同性 CSCLWU（图 2B）。

由于给予 0.03 PSI (1×) 的CSCLWU果蝇在FST中更加不动，并且没有增加它们在果蝇活动监测系统中的整体运动活性，因此选择该品系进行额外的实验。此外，由于雄性CSCLWU果蝇明显比雌性果蝇更不动，因此在随后的FST分析中对性别进行了独立评估。

图2

强迫游泳中的静止状态与整体运动活动无关，CIT可以减少这种不动性
将FST行为与第五天在用vehicle或vehicle介质中的药物喂养的果蝇活动监测系统中的整体运动活动进行比较（图 1）。使用的药物为 METH (5.0 mM)、αMT (3.0 mM) 和 CIT (0.3 mM、1.0 mM、2.5 mM)。

对自变量性别（雄性、雌性）和药物治疗（vehicle、METH）的双向方差分析发现，性别和治疗之间存在显著的交互作用，以及由性别和治疗引起的显著变异。饲喂vehicle的雄性活性显著低于饲喂vehicle的雌性。METH显著增加了雄性和雌性的运动活动（图 3A）。

自变量性别（雄性、雌性）和药物治疗（vehicle，αMT）的双向方差分析发现性别和治疗之间存在显著的相互作用，以及性别和治疗之间的显著变化。饲喂vehicle的雄性的活性显著低于饲喂vehicle的雌性。αMT显著降低雄性和雌性的运动活动（图 3B）。

对自变量性别（雄性、雌性）和药物治疗（vehicle、0.3、1.0和2.5 mM CIT）的双向方差分析发现性别和治疗之间存在显著的相互作用，以及两种性别引入的显著变异和治疗。饲喂vehicle的雄性活性显著低于饲喂vehicle的雌性。2.5 mM CIT 显著降低雌性的运动活动，但各组之间没有观察到其他差异。（图 3C）。

由于雄性在果蝇活动监测系统时活跃程度始终显著较低（图 2a、3a-c），因此使用单向方差分析独立评估性别的FST行为。CIT显著降低了雄性的不动性，增加了雌性和雄性的首次不动潜伏期，并减少了雄性的不动次数。与vehicle相比，METH或αMT的任何结果测量均未观察到显著差异（图 4）。

图3

图4

对PSI的总体运动反应因性别、剂量和用药策略而异
为了评估PSI对果蝇活动监测系统中整体运动活动的影响，给予PSI (0.03 mM、3.5 mM) (1x)。自变量性别（雄性、雌性）和药物治疗（vehicle，PSI 3.5 mM，PSI 0.03 mM）的双向方差分析发现性别和治疗之间存在显著的相互作用（图5A），并且因性别和治疗造成显著差异。对照雄性的活跃程度显著低于雌性。PSI在3.5 mM时降低雌性的运动活性，但在3.5 mM和0.003 mM时增加雄性的运动活性。

慢性和低剂量PSI对整体运动活动的影响不同
为了评估PSI在果蝇运动监测中的结果是否是由于5-HT1A或5-HT2A血清素受体的作用所致，在PSI（0.03mM）、WAY（1.0mM）、KET（1.0mm）及vehicle上饲养苍蝇5天（5×）。分析发现性别和药物治疗之间存在显著的相互作用，以及由于性别和药物治疗而产生的显著变化（图5B）。对照组雄性的活跃程度显著低于雌性。KET显著降低雌性和雄性的运动活动。WAY 显著降低了雄性的运动活动，但对雌性没有影响。接受PSI的雌性和雄性明显比接受 KET的同性更活跃。（图 5B）。

图5

PSI对强迫游泳中不动的影响与CIT相当
CIT 5× 能显著降低雄性的不动性、首次不动性潜伏期和阵发性不动性，并能显著降低雌性的首次不动性潜伏期和阵发性不动性。在 3.5 mM和 0.03 mM下，PSI能明显降低雄性的不动性；在 3.5 mM和 0.03 mM下，PSI能明显降低雄性第一次不动的潜伏期；在 3.5 mM和 0.03 mM浓度下，PSI能明显降低雄性不动的阵发性。（图6）。

图6

讨论
METH（图3A）和αMT（图3A）显著改变雄性和雌性果蝇的运动活动，但很大程度上不影响FST行为（图4）。相比之下，CIT (1.0 mM) 5× 不影响雄性或雌性果蝇的运动活动（图 3C），但显著降低雄性不动性、两性的不动潜伏期和雄性不动性发作次数（图 4）。因此，FST的运动活动与整体运动活动脱钩，并受到 SSRI 抗抑郁药物的选择性调节（图 4）。

高剂量和低剂量的PSI 1× 均显著降低了FST中雄性的不动行为（图 6），但也增加了果蝇活动监测中的整体运动活动。在FST的典型使用中，抗抑郁药物选择性地增加FST的活性，但不会增加整体运动活性。然而，在FST的典型使用中，所研究的药物是在测试后24小时内服用的。在此实验中，仅施用PSI一天，然后在测试前对果蝇施用vehicle 4天。与雌性和另一品系的雄性相比，CSCLWU雄性果蝇似乎特别不爱动（图2），因此 DAMS 和 FST 中运动活动的增加可能表明功能的增强和随后行为的正常化。支持这一假设的是，PSI（0.03 mM）5×以及 WAY 和 KET 5×降低了雄性 DAMS 的活动（图5B）。 WAY 对 5-HT1A 受体的慢性拮抗作用和KET对 5-HT2 受体的慢性拮抗作用导致了与慢性PSI相似的行为结果。因此，观察到的果蝇活动监测中活性降低可能是受体内化的结果。

参考文献
Hibicke M, Nichols C D. Validation of the forced swim test in Drosophila, and its use to demonstrate psilocybin has long-lasting antidepressant-like effects in flies[J]. Scientific Reports, 2022, 12(1): 10019.

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