抗体的生物素(Biotin)标记
生物素分子量小(244 Da),含活性羧基(-COOH),可通过化学键与目标分子的氨基、巯基等基团共价偶联。免疫检测ELISA/Western Blot:生物素化抗体 + SA-HRP,增强检测灵敏度。流式细胞术:生物素-荧光素(如SA-FITC)复合物分析细胞表面抗原。核酸分析原位杂交:生物素标记DNA/RNA探针定位基因表达。病原体诊断:如HPV检测试剂盒中的生物素化探针。蛋白质互作研究BioID技术:融合BirA酶的目的蛋白标记邻近蛋白,通过链霉亲和素磁钓富集后质谱鉴定等。
一般每个抗体可以标记3-5个生物素,标记时,生物素与抗体的比率受抗体浓度影响,对于10 mg/ml 的抗体溶液来说,生物素应超过抗体12倍(摩尔数),对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍,生物素也可以直接以粉末的形式加入抗体溶液中。待标记的蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。
生物素标记抗体
1)、抗体的前处理:
a. 选择适当截留的超滤柱中加入400μl 标记反应溶液(0.1M PBS pH 7.2),加入1mg抗体,混匀。
b. 4℃,6,000rpm,离心2min,弃滤液;于超滤柱中再加入200μl 标记反应溶液,混匀。4℃,6,000rpm,离心2min,
c. 重复步骤b 6到7次。
d. 混匀超滤柱中的残留的液体,室温静置1min;将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中,4℃,1000×g,2min,收集液体。
e. 取50μl PBS于超滤柱中混匀,静置1min。倒置超滤柱,4℃,6,000rpm,2min。收集液体。
f. 步骤d与步骤e的收集的滤液合并,用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml, 4℃放置备用。
2)、生物素的标记:
a. 将生物素溶解在其合适的溶剂中(请参照所选生物素的说明书,不同的生物素其溶剂不同),浓度为20mg/ml,按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液,室温反应1h。
b. 葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂。
c. 将抗体保存于合适的抗体保存液