产品信息

 一步法（快速/无缝）克隆试剂盒产品描述

Hieff Clone^TM One Step Pcr Cloning Kit一步法（快速/无缝）克隆试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，可高效克隆50 bp～10 kp片段。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。

试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶Exnase，Exnase中添加了独特的重组增强因子，显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (10⁷ cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)，而且Exnase还兼容常规酶切、PCR反应体系。

一步法（快速/无缝）克隆试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。

 一步法（快速/无缝）克隆试剂盒产品组分

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。产品-20 ºC保存。

实验流程

实验流程概览

1)    线性化克隆载体制备；

2)    插入片段扩增引物设计；

3)    插入片段PCR扩增；

4)    进行重组反应；

5)    反应产物转化、涂板；

6)    克隆鉴定。

图一 实验流程概览

注：插入片段PCR扩增时，引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列 (图中以蓝色和橙色标记)，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。

1. 制备线性化克隆载体

选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。

线性化载体可通过限制性内切酶酶切（单酶切或双酶切）或反向PCR扩增获得。

A．酶切制备线性化克隆载体

双酶切线性化：线性化完全，转化背景 (假阳性克隆) 低。推荐使用。

单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。

注：1）Hieff Clone^TM重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。

2）Hieff Clone^TM重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活)后可直接用于重组反应。

B．反向PCR扩增制备线性化克隆载体

推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (Hieff^TM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。

Hieff Clone^TM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。

克隆载体酶切产物或PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(>5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。

表一：线性化克隆载体的使用方式

注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl（重组反应总体积的1/5）

2. 制备PCR产物

2.1设计扩增引物

Hieff Clone^TM引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。

正向扩增引物设计方式：

5’——上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列——3’

反向扩增引物设计方式：

3’——基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列——5’

基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；

上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列（用于同源重组）。

以pUC18作为克隆载体为例，引物设计方案如图二所示。

图二 重组引物设计方案

注：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。

2.2 插入片段PCR扩增

插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A加尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增(Hieff^TM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60)，以减少扩增突变的引入。

PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff Clone^TM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。

PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(>5 kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。

表二：扩增产物推荐使用方式