透射电镜

透射电镜的应用：

透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50～100nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。

常用的方法：超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是挂预处理过的铜网上进行观察。

样本制备方法：

由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
    在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

取材的基本要求
组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷：
(1)．动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内(争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。
(2)．所取组织的体积要小，一般不超过1mm×1mm×1mm。也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
(3)．机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
(4)．操作最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
(5)．取材部位要准确。
取材方法：将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。

固定

固定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。固定的方法有物理的和化学的两大类。物理的方法系采用冰冻、干燥等手段来保持细胞结构；化学的方法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。现通常使用化学方法对组织或细胞进行固定。

常用固定剂：

1、四氧化锇(osmium tetroxide，)是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为1-2小时。

2．戊二醛(glutaraldehyde C5H8O2)，戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，长时间的固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆。

缺点是不能保存脂肪，没有电子染色作用，对细胞膜的显示较差。

组织块固定常规采用戊二醛—锇酸双重固定法。分预固定和后固定，中间用磷酸缓冲液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用1%锇酸固定液固定1～2小时，pH7.3～7.4。

固定完毕，用缓冲液漂洗20分钟后进行脱水。

(一) 细胞内部结构冷冻割断法
1．取材和固定：为了使细胞结构清晰，不被过多的血细胞污染，可在取材前用灌注法冲洗。即先将动物麻醉，经腹主动脉注入生理盐水或低分子量的右,切开下腔静脉放血，至无血色为止。然后迅速取材，将样品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%锇酸溶液中固定1小时，用1/15M磷酸缓冲液(pH7.4)清洗两次，每次10分钟。
2．二甲基亚浸泡：将样品依次放入25%、50%二甲基亚砜溶液中，各浸泡30分钟。
3．割断：用TF—1型冷冻割断装置进行割断。然后将割断后的样品放到50%二甲基亚砜中，等融化后再用1/15M磷酸缓冲液浸洗，每次10分钟，换液5次。
4．软化及后固定：将样品放入0.1%锇酸中软化，温度20(C，时间48～72小时。然后用1% 八固定1小时，双蒸水浸洗1小时，换液几次，需彻底清洗干净。
5．导电染色：将样品放入2%丹宁酸中2小时(或过夜)，以双蒸水清洗1小时，换液几次。再以1% 八固定30～60分钟，双蒸水清洗1小时。
6．脱水、干燥及镀膜：按常规方法进行。

结果展示

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