流式分选/流式检测细胞凋亡/流式检测细胞周期

流式分选

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状, 还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

服务内容：

淋巴细胞、造血干细胞、内皮细胞和成纤维细胞等多种细胞的分选。

客户须知：

客户须按流式细胞分选要求制备细胞样品，保证实验样品的绝对无菌，并同时提供阴性对照样品。

客户在提交样本前，需附详细书面说明材料，说明实验目的、样品来源及处理方法等信息，并详细说明检测要求。

流式细胞术检测细胞凋亡 

操作步骤
1、用预冷的PBS洗涤细胞两次,之后用1X的结合缓冲液重悬细胞, 调节细胞浓度到1X106Cells/ml;
2、取100μl调节好浓度的细胞悬液到5ml流式管底部;
3、加入Annexin V标记蛋白和相应的核酸染料(标记的Annexin V与核酸染料均需要摸索到合适的使用浓度,商品化试剂盒按照说明书操作);
4、均匀混合,室温避光反应15分钟;(若是用Annexin V-Biotin标记蛋白染色,反应后用1X的结合缓冲液洗涤细胞一次,再加入合适浓度的标记链霉亲和素Streptavidin,再加入合适的核酸染料,室温避光反应15分钟)
5、向流式管中加入400μl 1X的结合缓冲液,重悬后及时上流式细胞仪进行分析.操作注意事项

1、补偿对照管很重要;
2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞;
3、细胞浓度与染色用的蛋白量要合适;
4、对不同药物浓度和药物作用时间要进行摸索;

仪器：

实验所用的流式细胞仪为COULTER EPICS XL。

样本要求：

1）单个细胞：1~2×106 个细胞左右;来源于人、小鼠、大鼠或其它。

2）外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右;来源于人、小鼠、大鼠或其它。

流式细胞仪进行细胞周期检测（PI）

细胞周期的定义
生命是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

PI能够插入双链DNA中。它被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡的细胞的细胞膜。
1）PI单染色的固定方法：
1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2．3ml PBS洗一次。
3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。
5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。
6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

2）方法：
将样品细胞按程序描述的方法用FITC标记的单克隆抗体进行单色染色。
A、在最后的洗涤步骤后，将样品细胞悬浮于PI缓冲液中，于4℃下密封避光保存以备通过流式细胞仪分析；
B、在最后的洗涤步骤后，如前述将样品细胞悬浮后备用。如果您想检测样品细胞活力，在每一管中加入2μl的PI浓缩液，混匀。将样品置于4℃下密封避光保存以备流式细胞仪分析。

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