免疫组化

实验原理

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

实验方法

组织石蜡制作

（1）取材后，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定。

（2）脱水：将组织浸泡在75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇I、95%乙醇II、100%乙醇I和100%乙醇II中，各10min。

（3）透明：将脱水后的组织分别浸泡在 1/2二甲苯、二甲苯I和二甲苯II中10min。

（4）透蜡：将透明处理过的组织浸泡于融化的石蜡中3h。

（5）包埋。

（6）切片：用切片机将石蜡块中的组织切成5um厚的薄片，并平铺于防脱玻片上。

（7）烤片：将切片放置于55℃烤片机上，使组织片紧贴于防脱玻片上。

石蜡切片脱蜡复水

（1）脱蜡：将石蜡切片分别浸泡于二甲苯I、二甲苯II和1/2二甲苯中，各10min。

（2）复水：将脱蜡后的石蜡切片浸泡于100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇I、95%乙醇II、85%乙醇、75%乙醇中，各5min。

（3）双蒸水清洗3次，每次2min。

（4）PBS漂洗，3×2min；

抗原热修复

石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃-98℃之间并持续10-15分钟。取出容器，室温冷却10-20分钟。PBS清洗，下接免疫组化染色步骤。

免疫组化

（1）在切片组织上滴加0.5% TritonX-100室温打孔20min，PBS浸洗切片3次，每次3min。

（2）3%H2O2处理（室温）15min，PBS浸洗切片3次，每次3min。

（3）山羊血清室温封闭60min。

（4）取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗孵育4℃ 过夜。

（5）PBS清洗标本 3次 各 5 min。

（6）二抗工作液孵育37℃ 30 min。

（7）PBS清洗标本 3次 各 5 min。

（8）DAB显色（避光，镜下观察至棕色 ）1- 10min。

（9）蒸馏水洗 2次 5 min。

（10）苏木素复染 5min。

（11）自来水洗返蓝。

（12）梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。

（13）二甲苯透明2次3min。

（14）中性树胶封片。

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