EPI400 Electro EPI400 Electroporation-Competent Cell

产品规格: EPI400 Electroporation-Competent Cell 5×50μl pUC19(control vector) 10pg/μl 10μl F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG trfA tonA pcnB4 dhfr EPI400 电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。该菌株来源于 EC100 菌株，将 EC100 核基因中控制质粒拷贝数的 pcnB 基因删除后引入一个诱导启动子驱动的 pcnB 基因，即是 EPI400 菌株。EPI400 菌株可以降低质粒的拷贝数，特别适合于各种不稳定 DNA 或毒性基因的克隆，在加入诱导剂 CopyCutter Induction Solution 后又可以提高质粒产量到正常状态。[mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使 EPI400 菌株适合 于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的 DNA。recA1 和 endA1 的突变有利于插入 DNA 的稳定和高纯度质粒 DNA 的 提取。lacZΔM15 标记的存在使 DH10B 可用于蓝白斑筛选，tonA 赋予其抗噬菌体 T1 和 T5 的能力，rpsL 赋予其链霉素抗性。1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，待其沥干水分，正置 5 分钟，使乙醇充分挥发， 待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面 0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置 5 分钟充分降温。 2. 取-80℃保存的 EPI400 电击感受态细胞插入冰中 5 分钟，待其融化，加入目的 DNA (质粒或连接产物)并用手拨打 EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。 A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19；B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀 DNA 后加入适量 TE 缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA 浓度 不超过 100ng/μl，体积不超过 5μl/50μl 感受态。3. 用 200 μl 枪头将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为 BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推 荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。5. 2 分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入 700 μl 不含抗生素的无菌 S.O.C. 培养基（室温），用 1ml 枪吹吸电击 杯底部数次混匀后，转移到 50ml 离心管（BD Falcon50ml 锥形离心管等），向离心管中补加 S.O.C. 培养基至 5ml。 37℃，225 rpm 复苏 60 分钟。6. 5000rpm 离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 S.O.C 平板上（因菌量较大，若全部涂板 请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个）。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养 13-17 小时。1. 加入 DNA 时体积不应大于感受态体积的 1/10。 2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。3. 当 DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。 4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和 DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。操 作 说 明 注 意 事 项 5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个 数量级。 6. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀 DNA 后用适量 TE 缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产 物，保证 DNA 浓度不超过 100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。 7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通 200ul 枪头应剪去枪头尖 0.6cm) 避免用 力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。 8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。-