端粒酶重复片段扩增试剂盒(TRAP试剂盒)

中文名称：端粒酶重复片段扩增试剂盒(TRAP试剂盒)
英文名称：Telomeric Repeat Amplification Protocol Kit
产品规格：50次
本品是我司在经典TRAP技术基础上改良而得，专门用于快速测定人类细胞端粒酶的相对活性(需要跟对照样品比较)。端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP，它利用端粒酶能在外加的TS模板DNA的末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。原理如下：


产品特点：
1．一站式，提供从细胞裂解到PCR的所有试剂，但不含PAGE和银染试剂。
2．一管式操作，端粒酶延伸和PCR在同一体系中完成，方便快捷。
3．提供改良的、长为150bp的内参和含8个端粒序列的合成端粒，可有效排除PCR假阴性。内参长度远大于TRAP产物，不会干扰结果分析。
4．改良的TS模板和PCR引物，极大降低了引物二聚体的形成。
5．既可用于培养细胞，也可用于实体组织。
6．灵敏度高，最低可以检测到10个肿瘤细胞中的端粒酶活性。

试剂盒组成：

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、端粒酶的提取
注意：端粒酶是蛋白质和RNA组成的复合体，RNA极容易被降解，因此，提取端粒酶应该跟提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作，并且必须使用RNase-free的耗材，桌面最好用固相RNase清除剂清洁(BTN3090)清洁。
1．对冷冻的实体组织：将50-100mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入200μl预冷的TRAP细胞裂解液，温和手动匀浆数次后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次，然后直接进入第3步操作。为保证裂解效果，可在显微镜下观察。如果组织样品不足50-100mg，可以按比例降低TRAP细胞裂解液的用量。
2．对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷PBS洗涤105-106个经过胰酶处理的细胞或50-100mg新鲜组织，3000g 4℃离心5分钟，弃上清；加入200μL预冷的TRAP细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞：涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次。对组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次。如果细胞不足1×106或50-100mg，可按比例降低TRAP裂解液的用量。
3．12000-14000g 4℃离心20分钟。
4．收集160μL上清，先取部分用于测定蛋白质浓度，可通过测定215nm和225nm的光吸收得到，计算公式是蛋白质浓度(μg/μL)=0.144×(A215-A225)×稀释倍数，也可使用BCA法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/μL。知道各样品的蛋白浓度后，可用TRAP细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样便于比较，然后按10μL/管分装得到至少15管裂解物，放-80℃冷冻保存(可存放一年)。每个样品可取一管进行热灭活(95℃处理10分钟)后再放-80℃冷冻保存，此管将作为该样品的阴性对照。

二、TRAP反应
5．确定每个TRAP反应的细胞裂解物用量：为便于分析比较，每个TRAP反应所用的蛋白量(或细胞数)必须一样。由于细胞裂解物中一般都有高浓度的不明Taq DNA聚合酶抑制物(TRAP失败最常见的原因)，因此最佳结果往往是用稀释10-1000倍后的细胞裂解物得到。建议用一个样品稀释不同浓度做TRAP预实验。
6．在PCR管中按下表设置TRAP反应(50μL反应体系，以A和B两个样品为例)：

 注：为避免污染，最好等其他样品加完并盖上盖后再加合成端粒。
7．吹打混匀后进行PCR扩增，扩增条件(仅供参考，用户可优化)如下：

三、PAGE-银染检测及结果解读(本试剂盒不含PAGE-银染检测试剂盒)
8．取5μL PCR反应液进行10%非变性PAGE电泳-银染显色实验(需另购本公司PAGE电泳套装和银染试剂盒)。如果背景高(主要是由反应体系中的蛋白成分引起)，可以先进行PCR产物纯化再进行PAGE电泳和银染。
9．跟预期结果(见下表)比较。如果结果跟下表不一致，则需要按具体情况分析原因。

 注：本试剂盒所用引物产生的典型TRAP条带最小条带为59bp。

疑难解答：
1．如果样品管有内参带，但没有TRAP条带，可能是端粒酶活性低或者失活。制备细胞裂解物时可在TRAP细胞裂解液中加入1/100体积的RNase抑制剂以抑制RNase活性，并在端粒延伸反应后增加DNA纯化一步，纯化后的DNA再用于PCR。此两步法TRAP需要用户自备DNA纯化试剂和dNTP。
2．如果样品对照管(端粒酶已经灭活)出现TRAP条带，可能是TRAP产物污染，需要使用洁净的PCR管和PCR试管架。样品制备、PCR设置和电泳需在不同房间进行。也可能是端粒酶没有彻底灭活，建议用RNase酶解法或酶解+热灭活法。
3．实验阴性对照管的实验结果中出现TRAP条带，可能是引物二聚体，可采取两步法TRAP，并且将DNA模板加入到70℃预热的PCR Mix3.0中再进行PCR。
4．实验结果不好时，可以直接采取2步法，先做端粒酶延伸和灭活，然后再纯化DNA，用纯化的DNA做PCR。此法需要用户自备dNTP。 

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！