HE染色/免疫组化/TUNEL

HE染色

常规染色或HE（Haematoxylin and eosin）染色。它是病理技术中最常用的一种方法，通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法，以达到准确，完整的病理诊断。

染色目的

病理学的所有切片，都必须通过一种以上的染料，通过各种不同的方法，将切片中各种不同的物质，在不同染液的作用下，将其显示出来，使之在光学显微镜下，能够完全的观看各种结构。例如，HE染色，好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构，细胞核着蓝黑色，细胞浆着粉红色，软骨着蓝色等。清晰的结构为诊断提供可靠的依据，因此，染色技术也是病理技术中的重要组成部分，必须不断地总结，方能提高。如果染色不好，切片染色一团糟，红蓝不分，结构不清，层次不明，影响了镜下的观察，直接影响了临床诊断，染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。

染色方法及步骤
1．人工苏木素，伊红染色法（HE法）
(1)切片浸入二甲苯中5-10min；
(2)切片浸入二甲苯中5-10min；
(3)100%酒精1min。
(4)100%酒精1min。
(5)95%酒精1min。
(6)95%酒精1min。
(7)90%酒精1min。
(8)80%酒精1min。
(9)自来水洗1min。
(10)浸入苏木素染液浸染10-15min。
(11)自来水洗30second-1min。
(12)1%盐酸酒精分化30second。
(13)流水冲洗15min以上。
(14)1%伊红酒精染3-5min。
(15)90%或95%酒精分化30sec。
(16)95%酒精30sec-1min。
(17)95%酒精30sec-1min。
(18)95%酒精30sec-1min。
(19)100%酒精1min。
(20)100%

免疫组化

实验原理

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

操作方法：

（1）在切片组织上滴加0.5% TritonX-100室温打孔20min，PBS浸洗切片3次，每次3min。

（2）3%H2O2处理（室温）15min，PBS浸洗切片3次，每次3min。

（3）山羊血清室温封闭60min。

（4）取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗孵育4℃ 过夜。

（5）PBS清洗标本 3次 各 5 min。

（6）二抗工作液孵育37℃ 30 min。

（7）PBS清洗标本 3次 各 5 min。

（8）DAB显色（避光，镜下观察至棕色 ）1- 10min。

（9）蒸馏水洗 2次 5 min。

（10）苏木素复染 5min。

（11）自来水洗返蓝。

（12）梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。

（13）二甲***透明2次3min。

（14）中性树胶封片。

原位末端凋亡法（Tunel）实验技术

TUNEL 技术, 即脱氧核苷酸末端转移酶( Term inal2deoxynucleo t idyl t ran sferase, TdT)介导的x2dU TP 缺口末端标记(TdT 2m ediatedx2dU TP n ick end labeling, TUN EL )技术, 是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的新方法, 已广泛用于生物、医学研究领域。
TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法.细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNAfragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生,所以可以传达细胞凋亡的讯息.TdT为terminaldeoxynucleotidyl transferase,此种酵素可以在没有DNA模板的情形下,连结核甘酸到DNA的3'-OH处.1992年,以色列科学家Gavrieli等人将TdT引为为标定DNA片段的一个酵素,自此衍生出TUNEL此项技术.TUNEL的好处是可以在细胞凋亡发生的早期,即可侦测到DNA片段的产生,并且可以直接使用在组织切片上,观察细胞凋亡发生的位置.所以TUNEL目前为广泛接受与使用的一种细胞凋亡的分析方法. 
操作流程

1.石蜡切片，常规脱蜡至水; 石蜡切片4um贴在涂有切片粘合剂的载玻片上，58。C烤24h，常规脱蜡至水，二甲***Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 各10分钟，无水乙醇，95%，85%，75%乙醇，各2分钟，水洗2分钟。
2．0.3%H2O2作用  30min,室温，PBS洗3min×3次；
3．Proteinase K 20ug/ml  37℃ 20min
4．PBS洗3min×3次；
5．0.1%Triton×100 PBS洗3min×3次；
6．PBS洗3min×3次；
7．TUNEL混合液---1ml Tunel缓冲液中加入10ul  b-11-DUTP, 10ul  TDT, 37C  1h,室温1h
8．PBS洗3min×3次；
9．Streptavidin-HRP  1:400  37C  30min
10．PBS洗3min×3次；
11．0.04%DAB+0.03%H2O2显色10min，流水洗
12．苏木精衬染1min，盐酸乙醇分化，水洗
13．常规树脂封片

结果：

阳性结果为棕黄色（核）或棕褐色，背景呈紫蓝色。

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