DB3.1 电击感受态细胞 DB3.1 Electroporation-Competent Cell

产品规格: DB3.1 5×100μl pUC19（control vector） 10pg/μl;10μl F- gyrA462 endA1 glnV44 (sr1-recA)mcrBmrrhsdS20(rB -,mB -)ara14galK2lacY1proA2rpsL20(Smr) xyl5 Δleu mtl1 DB3.1 大肠杆菌菌株基因组中含有 gyrA462 基因，赋予其对 ccdB 毒性基因的抗性，特别适用于构建 或扩繁含有 ccdB 基因的质粒载体（例 GATEWAY System vector) ，此菌株具有链霉素抗性。High5 TM系列 DB3.1 感受态细胞经特殊工艺制作，经 pUC19 检测转化效率>10 10 cfu/μg DNA。 1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，待其沥干水分，正置 5 分钟， 使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面 0.5cm 以方便盖上 杯盖，冰中静置 5 分钟充分降温。 2. 取-80℃保存的 DB3.1 电击感受态细胞插入冰中 5 分钟，待其融化，加入目的 DNA(质粒或 连接产物)并用手拨打 EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。 A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19；B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀 DNA 后加入适量 TE 缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA) 重悬，DNA 浓度不超过 100 ng/μl，体积不超过 5 μl/50 μl 感受态。 3. 用 200 μl 枪头(用刀切除 0.5cm 枪尖)将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气 泡，盖上杯盖。 4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为 BioRad 电转仪推荐参数， 也可按所用 电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。 5. 立即 向电击杯中加入 1000 μl 不含抗生素的无菌培养基 S.O.C.，混匀后转移到空 50ml 管中，并用 1ml SOC 轻柔冲洗电转杯并转移到 50ml 管中，另补加 3ml SOC 培养基， 37℃， 200 rpm 复苏 60 分钟。 6. 5000 rpm 离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 S.O.C 平板上（因 菌量较大， 若全部涂板请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个）。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜 培养过夜。 1.加入 DNA 时体积不应大于感受态体积的 1/10。 2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。 3. 当 DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。 4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和 DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。 5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化 效率下降一个数量级。 6. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀 DNA 后用适量 TE 缓冲液(10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证 DNA 浓度不超过 100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。 7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效 率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。 8.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。