一、产品介绍

干细胞冻存保护液（hESC/ iPSC Cryopreservat ionSolution），是即行即用，无需程序降温，且无动物成分、无血清,化学成分明确，可在稳定细胞表型和生长状态和保持细胞多能性的同时提供最佳的细胞回收效率。

hESC/iPSC 细胞培养基试剂盒是厦门逸漠生物科技有限公司研发技术团队开发的一种适用于无饲养层培养，成分明确，补充多种生长因子的人多能干细胞（hPSC）无血清培养体系。hESC/iPSC 在 hESC/iPSC 细胞培养基中可以快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。

hESC/iPSC细胞培养试剂盒说明书下载

二、产品信息

表 1： hESC/iPSC 完全培养基 试剂盒产品内容

表 2： hESC/iPSC 其他相关试剂 产品内容

三、试剂材料

表 2：其他试剂&材料

四、 试剂准备

1 ）hESC/iPSC 完全培养基配制（500 mL ）

1. 在 4℃条件下解冻 hESC/iPSC Grouth SupplementsA/B，勿在 37℃培养箱/水浴锅解冻。

2. 参考表 表 3 在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成 hESC/iPSC 完全培养基，之后置于 4℃储存，封口膜封好后 2 周内使用。

3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置 100 mL,保证 2 周内使用完毕。

表 3：hESC/iPSC 完全培养基配置说明*

可根据实际用量将 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 分装后冷冻保存。具体配置比例可参考表 3 的配置说明。hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 冻融总次数不能超过 2 次。

2 ）Matrigel 铺板（以货号为 354277 的 的 Corning® Matrigel® 包被 6 孔板为例 ）

A. 装 分装 Matrigel

1. 货号 354277 的 Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以 Dilution Factor 表示，如某批次的推荐 Dilution Factor 为 278 μL，则表明 278 μL 可包被 4 块 6 孔板，分装数量=5 mL/0.278=17.98。

2. 准备 18 个无菌 1.5 mL EP 管，标记 Matrigel 日期、操作人；1mL 无菌吸头；EP 管架，均置于-20℃冰箱中预冷 1 小时。

3. 将 Matrigel 放置 4℃冰箱过夜解冻，当 Matrigel 完全解冻即可开始分装。

注：在解冻时，将 Matrigel 放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。

4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的 Matrigel、预冷的 1.5 mL EP 管及 EP 管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。

5. 混匀 Matrigel，无菌分装于各个 1.5 mL EP 管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。

6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 铺板

1. 取 36 mL 冷藏 DMEM/F12 于 50 mL 离心管中，准备 4 个 6 孔板，标记 Matrigel、批号、日期和操作人。

2. 1 mL 无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷 1 小时，取出一支冷冻的 Matrigel（5mL）置于 4℃冰箱解冻至完全化冻。

3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的 Matrigel、预冷的 1mL 吸头放置于生物安全柜上。

4. 用预冷的吸头向解冻过的 Matrigel（5mL），加入 1 mL 冷的 DMEM/F12 反复吹打解冻并混匀。

5. 吸出已解冻混匀的 Matrigel 加入离心管中剩余的 DMEM/F12，使用 10 mL 移液管再次反复吹打混匀。

6. 分装 1.5 mL/孔于 4 个六孔板中，轻轻摇晃混匀。

7. 培养板置于室温 1 小时后即可使用，或置于 4℃冷藏过夜，两周内使用。

五 、 复苏 hESC/iPSC （以 6 孔板为例）

1. 将水浴锅预热至 37℃。

2. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（15~30℃）。

3. 取 4 mL hESC/iPSC 完全培养基，按照 1:4000 比例加入 1 μL 的 hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（15~30℃）。

TIPS：不要在 37℃水浴锅中预温培养基。

4. 取出 1 支冷冻的细胞置于 37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min 内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。

5. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的 15 mL离心管中，随后逐滴加入 10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160 g 离心 5 min。

6. 吸弃上清，加入预温的 4 mL 的 hESC/iPSC 完全培养基混匀细胞，尽量避免吹打。

注：可留 20 μL 上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。

7. 吸除 6 孔板中 2 孔的 Matrigel 包被液，将混匀的细胞按照 2 mL/孔接种到 2 孔中。

8. 水平十字摇匀三次，置于 37℃，5% CO 2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。

9. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 完全培养基，之后每天更换培养基。

注：在 hESC 培养过程中，如果细胞的汇合度超过 50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至 3-4mL/孔。

表 4： hESC/iPSC 传代&培养操作试剂推荐用量

六 、传代 hESC/iPSC （以 6 孔板为例）

1. 传代条件：① 细胞汇合度达 85%左右（如图 1(C-D)所示），一般情况下每 3-4 天传代；

② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。

2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按 1:5~1:12 的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度 85%，大小均匀（如图 1(C-D)所示），建议按照 1:8 进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。

注：1:8 传代就是 1 个孔瓶传 8 个孔（以 6 孔板为例）。

3. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（~25℃）。

4. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培养基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C( IMC-014-Y） ，恢复至室温（~25℃）。

图 1.hESC/iPSC 完全培养基连续培养 hESC 细胞形态图 ：（A ）和（C ） 分别为 hESC 细胞培养第 2 和 4

天时 低倍镜 hESC 培养 形态图示， （B ）和（D ） 为培养至第 2 和 和 4 天时的 高倍镜 hESC 培养 形态图。

5. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（~25℃）。

6. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培养基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。

7. 将孔内培养基吸取，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸取。

8. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆盖孔底。

9. 置于 37℃培养箱中孵育 8-9 min。

注：① 消化 8-9 min 后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；

② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及时加入 2 mL/孔预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃 6 孔板使细胞脱离基质。

注：① 加 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 时，可轻柔吹打细胞 1-2 次，不能超过 2 次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。

② hESC 不能长时间处于 hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过 4 孔（六孔板）。

图 2 ： 消化 hESC 细胞不同时间 形态图 ： （A ） 消化 8 min 低倍镜 hESC 培养的 的形态图; （B ） 消化 9 min

低倍镜 hESC 培养的 的形态图。

12. 吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在 6 孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤 9 获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤 9 获得的细胞悬液收集至 2 mL 离心管，轻柔颠倒混匀细胞 1-2 次；再按照传代比例接种。

14. 接种后，水平十字摇匀 6 孔板三次，置于 37℃，5% CO 2 浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀 6 孔板三次，培养过夜。

15. 18-24 小时后更换新 hESC/iPSC 完全培养基，此后每天换液，4-5 天后继续传代/冻存。

七、冻存 hESC/iPSC

1. 当细胞汇合度达 85%左右（如图 1(C-D)所示）可收获冻存，一般 6 孔板每孔可冻存 1 管。

2. 准备相应数量的 1.5/2 mL 冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意 摇匀。

4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。

5. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于 37℃培养箱中，计时 8-9 min（可

参考“ 六、传代 hESC/iPSC”步骤）。

6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution。

7. 摇匀预温的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL 冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀 3 次，随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。

8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。

八、其他培养体系中 hESC/iPSC 更换为 hESC/iPSC 完全培养基条件的适应

其他无饲养层条件培养的 hESC/iPSC 可以在细胞状态良好时，使用原培养基进行细胞传代，24 小时后更换成混合培养基（原培养基与 hESC/iPSC 完全培养基按照 1:1 混合）培养，培养 2 代后完全换成 hESC/iPSC 完全培养基培养，培养 2-3 代后可完全适应新的培养体系，此时可进行细胞冻存处理。