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实验原理
实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR所使用的荧光化学试剂可分为两种：荧光染料和荧光探针。
荧光染料SYBR Green：嵌入到双链DNA分子后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，见图 4.1。
图 4.1 SYBR Green 荧光染料法qPCR检测原理图
TaqMan 荧光探针：扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，见图 4.2。
图 4.2 TaqMan 荧光探针法qPCR 检测原理图
SYBR GREEN 法和 TaqMan 探针法的区别
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方法 |
优点 |
缺点 |
应用 |
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SYBR GREEN 法 |
方便快捷，不必针对各 个基因设计合成TaqMan 探针，具有价格优势。 |
无模板特异性，对引物特异性要求较高，需进行熔解曲线分析；灵敏度相对较低。 |
应用于基因的差异表达分析，比如RNA干扰效果确认。 |
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TaqMan 探针法 |
荧光化合物标记到特异 性的寡核苷酸上，具有高度特异性，重复性好，荧光信号强。 |
只适合一个特定的目 标，探针价格较高。 |
通常应用于基因拷贝数的确定，在临床诊断中最常用，比如病毒和病原菌定量检测。 |
技术应用
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定量方法 |
原理 |
技术应用 |
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绝对定量 (Absolute Quantification，AQ) |
是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。 |
病原体检测； 转基因食品检测； 基因表达研究。 |
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相对定量 (Relative Quantification， RQ) |
测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。 |
基因在不同组织中的表达差异；药物疗效考核；耐药性研究。 |
实验流程
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实物 |
数据信息 |
实验周期 |
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客户提供 |
样本 |
靶基因NCBI登录号 |
4周 |
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我们提供 |
无 |
基本实验步骤、EXCEL原始数据扩增线，溶解曲线 |
实验结果展示
1）目的基因
2）内参基因
3）柱形图
图 4.3 A、B 两种细胞经加药处理后目的基因在各个时间点的qPCR相对定量表达量检测
1）目的基因的扩增曲线与熔解曲线；2）内参基因的扩增曲线与熔解曲线 ;
3）目的基因在 A、B 两种细胞加药处理后各个时间点的表达量柱形图（2-ΔΔCt相对定量数据处理)。
扩增曲线和溶解曲线的常见术语：
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基线 Baseline |
在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即称为基线。 |
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荧光域值 Threshold Value |
一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是3-15个循环荧光信号标准差的10 倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 |
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Ct 值 Threshold Cycle |
扩增产物的荧光信号进入指数增长期时所经历的循环数。模板的Ct值与起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。 |
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熔解曲线Tm值 Tm Of Melting Curve |
SYBR Green染料发实验结束后需对qPCR产物加热，随着温度的升高，双链接扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降，将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同，从而可对PCR的特异性进行鉴定。 |
TROUBLESHOOTING
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实验问题 |
原因 |
推荐解决方法 |
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Ct 值起跳过晚 |
引物设计不佳 |
重新设计引物，RT—PCR |