HB170426
Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit
一步法快速克隆试剂盒
产品信息
产品名称
货号
规格
储存
价格（元）
Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit
 一步法快速克隆试剂盒
11ES25
25 T
-20℃
655.00
11ES62
5×25 T
-20℃
2455.00
产品描述
Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp-20 bp)。将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶的催化下，仅需反应20 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。
试剂盒中 2×Hieff clone Enzyme Premix 预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了独特的重组增强因子，显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)，重组体系还兼容还兼容常规酶切、PCR反应体系。
该试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。
产品组分
编号
组分
产品编号/规格
10911ES25 (25 T)
10911ES62 (5×25 T)
10911-A
2×Hieff Clone Enzyme Premix
250 μL
5×250 μL
10911-B
500 bp control insert (25 ng/μL)
5 μL
5×5 μL
10911-C
pUC 19 control vector, linearized (50 ng/μL)
5 μL
5×5 μL
运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。产品-20 oC保存，有效期1年。
实验流程
实验流程概览
1）线性化克隆载体制备；
2）插入片段扩增引物设计；
3）插入片段PCR扩增；
4）进行重组反应；
5）反应产物转化、涂板；
6）克隆鉴定。
 


 
图一 实验流程概览
1. 制备线性化克隆载体
选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围之内时，重组效率将达到最大。
线性化载体可通过限制性内切酶酶切（单酶切或双酶切）或反向PCR扩增获得。
A．酶切制备线性化克隆载体
双酶切线性化：线性化完全，转化背景 (假阳性克隆) 低。推荐使用。
单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
【注】：① Hieff CloneTM重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。
② Hieff CloneTM重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活)后可直接用于重组反应。
B．反向PCR扩增制备线性化克隆载体
推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (Hieff CanaceTM High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
Hieff CloneTM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
克隆载体酶切产物或PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(>5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。

表一：线性化克隆载体的使用方式
线性化载体制备方式
模板类型
快速实验方案
最佳实验方案
酶切消化制备
环状质粒
加入失活内切酶后直接使用
胶回收
PCR制备
扩增特异
环状质粒
DpnI消化后直接使用（降解扩增模板）
胶回收或DpnI消化后胶回收
预线性化质粒、基因组、cDNA
直接使用
胶回收
有明显非特异性扩增
胶回收
【注】：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μL（重组反应总体积的1/5）。
2. 制备PCR产物
2.1设计扩增引物
Hieff CloneTM引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp-25 bp)。
正向扩增引物设计方式：
5’——上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列——3’
反向扩增引物设计方式：
3’——基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列——5’
基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；
上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列（用于同源重组）。
以pUC18作为克隆载体为例，引物设计方案如图二所示。
 
 A. 如克隆载体选用双酶切线性化（Hind III + EcoR I）：
 
 
B. 如克隆载体选用单酶切线性化（BamH I）：
（注：克隆完成后插入片段两端都具有完整的BamH I酶切位点）
 
C．如克隆载体选用PCR扩增制备：
（注：克隆完成后插入片段将与载体无缝拼接）
图二 重组引物设计方案
【注】：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算，为了得到高效率克, 隆，建议Tm≥48℃。
2.2 插入片段PCR扩增
插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A加尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增(Hieff CanaceTM High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES)，以减少扩增突变的引入。
PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff CloneTM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5 kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。

表二：扩增产物推荐使用方式
PCR扩增情况
PCR模板类型
快速实验方案
最佳实验方案
扩增特异
与克隆载体抗性相同的环状质粒
DpnI消化后直接使用*
胶回收或DpnI消化后胶回收
预线性化质粒、基因组、cDNA
直接使用
胶回收
有明显非特异性扩增
胶回收
【注】：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μL（重组反应总体积的1/5）。TUNEology 波长可调检测卡盒-->