柯达胶片（X光片） 感蓝 5*7

柯达胶片（X光片） 感蓝 8*10

该产品可应用于western blot 实验中 最后显影

western blot 实验相关流程

 Western Blot简介

Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。

Western Blot一般流程

1、蛋白样品制备：用于蛋白质免疫印迹的样品为蛋白质的溶解液，可以是纯化后的蛋白质样品，也可以是组织细胞裂解液。

2、蛋白定量：评估电泳上样量或检测蛋白含量大小。先总蛋白定量，western后在依据内参定量。

3、电泳：依据需要检测蛋白的分子量选择胶的浓度，制胶，电泳。

4、转膜：将聚丙烯酰胺上的蛋白质转移至薄膜上，常用半干转或湿转。

5、封闭：选择适当封闭剂将膜上蛋白质结合位点封闭阻断。

6、一抗孵育：一抗与特异性抗原的结合。

7、二抗孵育：二抗与抗原上结合的一抗的再结合过程。

8、底物显色：二抗一般为标记抗体，根据二抗上的标记物来选择显色底物进行检测。

9、图片分析：标定Marker，进行分析与扫描 。

一、蛋白样品制备与蛋白定量（单独介绍）

二、蛋白凝胶电泳SDS-PAGE

SDS-PAGE原理：

蛋白质既含有能解离成带正电荷的氨基，又含有能解离成带负电荷的羧基，可以进行两性电离。蛋白质的电离受溶液pH值的影响，在酸性环境中，蛋白质分子电离成阳离子，在碱性环境中，则电离成阴离子。蛋白质阴、阳离子在电场中分别向正、负电极移动，这种带电荷的蛋白质，在电场中向电性相反的电极移动的现象称为蛋白质电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N,N’—亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)

在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳.聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。

蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇等的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开， SDS能按一定比例与蛋白质结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异.因此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳时的迁移率不再受蛋白质原有电荷与分子形状影响，只与蛋白质分子量大小相关。

SDS-PAGE实验步骤：

1， 根据目标蛋白分子量大小，选取凝胶浓度，按下表配制。先配分离胶，再配浓缩胶。

2， 将蛋白样品与蛋白上样缓冲液按比例混匀，100℃或沸水浴加热3-5分钟。

3， 安装电泳槽，倒入电泳缓冲液。拔出梳子，将蛋白质样品与蛋白marker加到上样孔内。将电泳槽与电泳仪相接，调节电压电流参数，开始电泳。

4， 观察指示剂条带电泳状况，染料到达胶的底端附近即可停止电泳。

5， 取出PAGE凝胶，染色或进行下一步的转膜实验。

6， 蛋白胶染色：

常用的凝胶上蛋白质染色方法主要有染料染色法、银染法、负染法和荧光染色法。实验室最常见的染色方法为考马斯亮蓝染色法。

配置考马斯亮蓝染液与脱色液，电泳完成后取出PAGE胶放入考马斯亮蓝染液中染色2小时左右，具体染色时间可根据蛋白样品的丰度做相应调节。脱色时将PAGE胶放到脱色液中，置于摇床上，期间可更换脱色液数次，脱色至蛋白条带清晰显示为止。经过考马斯亮蓝染色的蛋白胶不建议再用于转膜实验。

三、Western转膜实验

转膜简介：

将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。

杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。

最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。

转膜步骤（以槽式湿转为例）

1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡5-10 min。

2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10 min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。

3. 装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，赶去气泡。

4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治，加转移缓冲液，插上电极，设置电流电压，开始电泳。

5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

转膜后检测（可选步骤）

转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

转膜完毕后，用TBS（或PBS）洗膜1-2分钟，以洗去转膜液。放入丽春红染色液中染色。蛋白带出现后水洗。

四、免疫反应：

1，封闭

原理：用非抗原的蛋白去封闭膜的蛋白质结合位点，避免标记抗体固定在膜上引起背景增高，常用的封闭液有BSA,脱脂奶粉,明胶, tween-20等,一般脱脂奶粉。

实验步骤：

5%脱脂奶粉（用1x TBS配制，或1xTBST配制）封闭过夜 或室温1~2小时

2，一抗、二抗孵育

原理： 一抗可以与要检测的蛋白特异结合，二抗可与一抗结合，同时二抗上带有特异的酶（如辣根过氧化物酶HRP，碱性磷酸酶法AP等 ),标记酶可以分解化学显色底物产生有颜色的条带或催化化学发光底物使胶片感光。

实验步骤：

一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4度过夜（抗体浓度及孵育时间需根据不同的抗体做相应调整， 1xTBST，洗膜3次，每次5分钟。

二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时， 1x TBST,洗膜3次，每次5分钟。

五、底物显色

Western底物显色根据二抗的性质来选择，荧光标记二抗孵育后可用荧光扫描系统扫膜成像。酶标记二抗根据酶的种类来选择显色底物。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光和底物显色。最常用的为辣根过氧化物酶HRP标记二抗和碱性磷酸酶AP标记二抗：

Western blotting中HRP的常用生色底物显色有DAB， AEC等，ECL是是经典的HRP化学发光底物。AP的常用生色底物显色有BCIP/NBT。

1． HRP-ECL发光法： 将按说明配置显色底物，混合物覆盖在膜表面。 用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。 在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即显影、定影。标定Marker，进行分析与扫描。根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

2． HRP-DAB显色：

膜在抗体孵育后适当洗涤，配置DAB工作液。向膜上加入适量DAB工作液，覆盖样品。 室温避光孵育至显色至预期深浅。 洗涤终止显色反应。分析拍照。膜可室温晾干避光保存。

相关试剂：

SDS-PAGE电泳：

蛋白胶配置：

P1300 SDS-PAGE凝胶制备试剂盒

A1010 30%丙烯酰胺(29:1)（丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺）

T1020 1M Tris-HCL (PH6.8)

T1010 1.5M Tris-HCL (PH8.8) （T8060 TRIS）

A1030 10%过硫酸铵[AP,APS] （A8090 过硫酸铵）

S1010 10%SDS （S8010 SDS）

T8090 TEMED

A1012 丙烯酰胺溶液（定制）

A1025 40%丙烯酰胺（37.5:1）

S1051 4×SDS-PAGE分离胶缓冲液（PH=8.8）

S1052 4×SDS-PAGE浓缩胶缓冲液（PH=6.8）

D1070 1M DTT（D8220 DTT）

蛋白电泳：

PR1300 超低分子量蛋白MARKER

PR1400 低分子量蛋白MARKER

PR1500 次高分子量蛋白MARKER

PR1600 预染低分子量蛋白MARKER

PR1700 预染次高分子量蛋白MARKER

PR1800 Western blotting蛋白MARKER

P1015 4×蛋白上样缓冲液（含DTT）

P1016 4×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇）

P1017 4×非变性蛋白上样缓冲液

P1018 2×蛋白上样缓冲液（含DTT）

P1019 2×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇）（B8120 溴酚蓝 G8190 甘油 S8270蔗糖 M8210β-巯基乙醇）

T1070 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（G8200 甘氨酸）

P1300-500 考马斯亮蓝快速染色液（C8420 考马斯亮蓝G-250、C8430考马斯亮蓝R-250）

P1305 考马斯亮蓝染色套装（染色液+脱色液）

R8070 剥离硅烷

B8150 亲和硅烷

转膜：

印记膜：尼龙膜、PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）

3030 3MM滤纸

P0012 10×丽春红（P8330丽春红S）

D1060 10×电泳转移缓冲液

封闭、抗体孵育：

T1080-500 20*TBS

T1081-500 10*TBST

T1085-500 1*TBST（T8220吐温 -20）

SW3010 膜封闭液

SW3015 5%BSA封闭液（A8010、A8020、126575牛血清白蛋白BSA）

D8340 脱脂奶粉

C8200 酪蛋白

SW3020 膜再生液

抗体：一抗、二抗

SE系列 HRP标记二抗、SF系列FITC标记二抗

SH1酶标记亲和素HRP 、SHB2生物素化羊抗人IgG

A1800 抗体稀释液（普通型）

A1810 一抗稀释液

A1820 HRP标记抗体稀释液

A1830 AP标记抗体稀释液

A1840 荧光抗体稀释液

Western信号检测：

PR1100 BCIP/NBT地物显色试剂盒（B8090 BCIP、N8140 NBT）

A2010 AEC显色试剂盒（20×）（A5754 AEC）

DA1010 DAB显色试剂盒（20×）（D8230 DAB-4HCL）

PE0010 ECL Plus荧光检测试剂(ECL超敏发光液)

PE0010 ECL Plus荧光检测试剂(ECL超敏发光液)

PE0010 ECL Plus荧光检测试剂(ECL超敏发光液)

SW1010 Western blotting（小鼠IgG）DAB法显色试剂盒

SW1020 Western blotting（兔IgG）DAB法显色试剂盒

SW1030 Western blotting（山羊IgG）DAB法显色试剂盒

SW1040 Western blotting（小鼠/兔IgG）DAB法显色试剂盒

SW2010 Western blotting（小鼠IgG）ECL化学发光法检测试剂盒

SW2020 Western blotting（兔IgG）ECL化学发光法检测试剂盒

SW2030 Western blotting（山羊IgG）ECL化学发光法检测试剂盒

SW2040 Western blotting（小鼠/兔IgG）ECL化学发光法检测试剂盒

XYF 显影粉

DYF 定影粉

AH 暗盒

增感屏

JPKD-5*7胶片

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